ELISA基本方法

ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

ELISA基本原理

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

ELISA基本操作步骤

方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

在包被溶液中稀释纯化的包被抗体（一般0.5-4μg/ml），将该稀释后的包被抗体100μl/孔加入到酶标板内。

用封板膜将板封好防止蒸发，在室温（或4℃）孵育过夜。

吸干每一板孔并加洗液洗涤，重复3次。使用洗瓶、多道移液器、多功能分装器或洗板几，每孔加400μl彻底洗涤。规范的操作要求每步完全移出孔中的液体。最后一步，将板中液体移出并将板子在干净的纸巾上吸附。

加200-300μl/孔封闭液封板，室温至少孵育1小时。

重复步骤3，可利用真空泵干燥板子。加入干燥剂并封板，至少在4-8℃可贮存2个月。

每孔加100μl适当稀释的标准品和标本，轻轻敲打板子1分钟。贴上封板膜，室温孵育2小时。

重复步骤3

每孔加100μl经过适当稀释的生物素化的检测抗体，贴上新的封板膜，室温孵育2小时

重复步骤3

每孔加100μl经过适当稀释的Avidin-HRP或 Streptavidin-HRP，也可加其它种类预先优化物

重复步骤3

每孔加100μl底物溶液，避光，室温孵育5-30分钟进行显色反应

每孔加50μl终止液，轻轻振荡板子确保充分混匀

结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

方法二　用于检测未知抗体的间接法：

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。

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加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)

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于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。

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其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

ELISA需要的基本试剂：

捕获抗体

检测抗体

链霉亲和素-HRP

标准品

96孔酶标板：选择具有中等或高吸附力的酶标板，禁止使用培养板

包被溶液：0.1M的PBS或者TBS，PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液

阻断溶液：含3％BSA的TTBS或PBS，或者含有3-5%血清的PBS

标准品/标本稀释液：含1％BSA的TTBS或PBS

洗液：含0.02％吐温20的0.002M咪唑盐溶液或者PH7.4的PBS溶液

底物溶液：两组份或者一组份的TMB显色液

终止液：2N的硫酸或者1％HCl溶液

封板膜

ELISA标本的制备和贮存

检测可溶性蛋白：根据产品说明书制备血清、血浆标本，由于有些样品对温度敏感极易丧失活性，应尽快分离并分装（一般300～500ul/管），大多数标本收集和实验在同一天应贮存在2～8℃。若无法立即测定，应贮存在-70℃，标本贮存时间一般不宜过长，避免反复冻融。使用前将标本平衡至室温，融化标本严禁使用水浴锅。冻存后或冷藏时间过长的标本可能会出现沉淀或小凝集块，应在实验前离心或过滤（0.45um滤膜）标本，体积少的标本不建议过滤。所有标本的收集要使用无菌管，在无菌/半无菌条件下操作防止污染。

血清：将血液在室温凝集10～15分钟，1500g离心20～30分钟，小心吸取血清。

血浆：按试剂盒中的说明书选择抗凝剂。收集血液时，轻轻摇动试管使抗凝剂与血液充分混合。将血液在室温保存10～15分钟，1500g离心15～20分钟，小心吸上层血浆。

尿液：将尿液收集在无菌的容器内。1500g离心10～15分钟或过滤（0.45um滤膜）去除杂质。注意：对于尿液标本实验的回归系数可能发生变化。

细胞培养上清液：1500g离心10～15分钟去除细胞和细胞残渣。若使用常规典型的培养基，应制备两条标准曲线，一条使用标准品稀释液/或实验缓冲液配制标准品，另一条以细胞培养基配制标准品。若两条标准曲线的变化范围在10%内，实验结果可用任一曲线分析。

检测细胞相关和细胞内蛋白：细胞相关蛋白和其它细胞内蛋白在ELISA实验前需要对标本进行处理将目的蛋白释放出来。