RNA纯化常见问题和解决方案（上）

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Western Blot标准实验步骤

成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：

• 阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率
• 阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性
• 二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性
• 内参对照：检测标本的质量和二抗系统
• 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果

WB检测基本过程

1、提取抗原蛋白
将提取RNA途中留存的样品，加入150μl100%酒精充分混匀，静置5min(RT),2000×g,4℃离心5min,吸取上清至新管中,加入750μl异丙醇,混匀,静置10min(RT),12000×g,4℃离心10min,弃上清,加入1ml0.3mol/L盐酸胍/95%酒精重悬沉淀,用加样器打散沉淀,混旋20~30秒,静置20min(RT),7500×g,4℃离心5min,弃上清,重新加入1ml0.3mol/L盐酸胍/95%酒精两次,重悬沉淀,离心后弃上清,加入100%无水乙醇1ml,混旋1min,静置20min(RT),7500×g,4℃离心5min,弃上清,真空干燥5min,50μl1%SDS溶解沉淀，用50℃热水助溶，直至全部溶解。10000×g,离心10min,去除沉渣。

注意选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！

2、蛋白定量

常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白

3、电泳分离蛋白质

1）.makegel．

11%分离胶 12ml 两块胶	4%积层胶6ml两块胶
DW            4.36 ml	DW        堵漏     3.66ml
3M  Tris        3.0 ml	0.5M  Tris           1.5 ml
30%Arc         4.4 ml	30%Arc    0.5 ml     0.78 ml
10%SDS        0.24 ml	10%SDS              60 ul
10%APS        0.12 ml	10%APS    20ul      30 ul
TEMED         10ul	TEMED     5ul       6ul

2）.上样前样品处理：
样品100℃、3分钟、冷却，900×g、离心30S。
3）.通电电：积层胶电泳电压50V左右，分离胶电泳电压90～110V。
4）.考马斯亮蓝染色：1小时，1号脱色1小时，2号脱色2小时。

4、转膜

根据不同的检测目的和待测蛋白的特性，选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有：PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：

	PVDF膜	NC膜	尼龙膜
灵敏度和分辨率	高	高	高
背景	低	低	较高
蛋白结合能力	100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合）	80-100ug/cm2	>400ug/cm2