RNA纯化常见问题和解决方案（下）

 

机械强度

强

干的膜易脆

软而结实

溶剂抗性

强

差

差

使用前是否需要浸润

100%甲醛润湿

缓冲液润湿

缓冲液润湿

适用染色方法

胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰

胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁

不能用阴离子染料

适用检测方法

显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测

显色法、化学发光、荧光、放射性

显色、化学发光、放射性

适用范围

普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测

普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白

低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用

价格

高

较低

低

 

5、封闭

去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。常用的封闭溶液有：含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS

6、一抗孵育

一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：

• 选择适合检测标本种属的一抗
• 选择适用于WB实验方法的一抗
• 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体

 

 

WB常用内参及其技术参数：

内参名称	分子量大小	适用范围
beta-actin	43kDa	胞浆和全细胞
GAPDH	30-40kDa	胞浆和全细胞
Tubulin	55kDa	胞浆和全细胞
VCDA1/Porin	31kDa	线粒体
COXIV	16kDa	线粒体
TBP	38kDa	细胞核

7、二抗孵育

根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时

8、底物孵育

选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量

9、结果分析和检测

凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片

成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：

1.      凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析

2.      吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析

3.      处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上

4.      处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测

Note：从封闭开始，每步之间都需要用TBST进行洗涤，3次，每次5min。

 

 

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