流式细胞仪检测专题（一）

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测

细胞因子是可溶性小分子蛋白或者多肽，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。早期细胞因子表达与 T 细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞 (T 、 B 、 NK) 不能分泌细胞因子。

胞内流式细胞术的发展是基于 Jung 与 Picker 采用 monensin ， PMA ， BFA 和 Monensin 等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法刺激 T 细胞活化，阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强的细胞因子信号可被流式细胞仪检测。同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。该方法具有其它方法难以比拟的优点：

1、快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需 6-8 小时，实际操作时间为 1-2 小时，快速简便；

2、简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离 PBMCs ；

3、灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；

4、高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；

5、安全：减少样本处理与生物源性污染；

6、接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。

一、常用的标本类型和处理方法

全血 ：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、 EDTA 和 ACD 抗凝剂，血样在 8 小时内分析，超过 8 小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少 5% 。如不能在 8 小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

自身血浆中外周血单个核细胞 (PBMCs) ：使用肝素钠抗凝的采血后，分离 PBMCs ， 24 小时内分析。

组织培养基中的外周血单个核细胞 (PBMCs) ：用 Ficoll 分离 PBMCs ，将细胞重悬于含 10% 热灭活胎牛血清 (FBS) 的 RPMI － 1640 培养基中，调节细胞浓度为 2 × 106 细胞 /ml 。

细胞系与 T 细胞克隆 ：调节细胞浓度 2 × 106 细胞 /mL 于新鲜培养基中。

冰冻全血与 PBMCs ：使用 1 ×红细胞裂解液处理活化的外周血或者 PBMCs ，用 PBS 漂洗，并用含 1% 的 BSA 及 10% 的 DMSO 的 PBS 重悬， -70 ℃冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上 2 ～ 3mL 的洗液，离心 5 分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。