流式细胞仪检测专题（二）

二、所需试剂

1 、荧光标记的细胞表面分子及胞内因子的单抗试剂（ eBioscience 公司提供品种丰富的不同荧光标记的抗体，详细抗体信息可登陆 eBioscience 的网站www.ebioscience.com 查询，或直接在欣博盛公司的网站上搜索。）

2 、溶血素：用外周全血检测时需使用溶血素（ eBioscience ，目录号 00-4333-57 ）溶解红细胞。

3 、激活剂

(1) 佛波脂 Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA) （ Alexis ，目录号 ALX-445-004 ）

用 DMSO 配制，调节浓度至 0.1mg/mL ，分装 20 μ L/管 ， -20 ℃储存。勿反复冻融；每次实验用无菌无叠氮钠 PBS 1 ： 100 稀释储存液， PMA 使用终浓度为 25ng/mL 细胞悬液。

(2) Ionomycin   （ Alexis ，目录号 ALX-450-006 ）

于乙醇中配制成浓度 0.5mg/mL ， -20 ℃储存。每次实验用无菌无叠氮钠 PBS 1 ： 10 稀释储存液， Ionomycin 终浓度为 1 μ g/mL 细胞悬液。

(3)Staphylococcal enterotoxin B(SEB) ( Sigma ，目录号 S-4881 )

用无菌无叠氮钠 PBS 调节浓度 0.5mg/mL ， 4 ℃储存； SEB 终浓度 10 μ g/mL 细胞悬液。

(4)CD3 ：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞。

(5)CD28 ：加速不同刺激剂（包括 SEB 、 CD3 等）的活化效应，浓度一般为 10ug/ml 。

4 、阻断剂：阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内。

(1)Brefeldin-A(BFA) （ eBioscience ，目录号 00-4506-51 ）

于 DMSO 中调节浓度 5mg/mL ，分装 20 μ L/管 ， -20 ℃储存。勿反复冻融。每次实验用无菌无叠氮钠 PBS 1 ： 10 稀释储存液，激活最后 4 － 5 小时 BFA 终浓度为 10 μ g/mL 细胞悬液。

注意： BFA 过度孵育会导致细胞活力下降

(2) Monensin （ eBioscience ，目录号 00-4505-51 ）

5 、不含谷氨酰胺的 RPMI-1640

6 、固定剂：细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。（ eBioscience ，目录号 00-8222-49 ，含 4% 的多聚甲醛的 PBS 溶液）

7 、破膜剂：含 1 ％皂甙、 0.05 ％叠氮化钠的 Hanks 溶液（ HBBS ）（ eBioscience ，目录号 00-8333-56 ），

将细胞膜穿孔，利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与相应的细胞因子结合。

8 、其他试剂：无菌无叠氮钠 PBS ，乙醇，含 1% 多聚甲醛的 PBS ， 4 ℃ 储存。