流式细胞仪检测专题（四）

四、注意事项

1、标本处理：避免使用络合钙的抗凝剂，如 ACD 与 EDTA ，因为它们会限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。此外 LPS ，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞激活剂，可能会混淆试验结果。血样在 8 小时内分析，超过 8 小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少 5% 。如不能在 8 小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

2 、刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测 IFN- γ则可选择 PMA 和 Ionomycin 同时刺激；如果用 CD4 做表面标记，由于多数病人的 CD4 抗原会因 PMA 的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长， 4-6 小时为宜，否则 CD4 下调影响分析。

3 、选择合适的对照：为保证结合的真是和可靠性，至少荧光设置以下对照：

(1) 未刺激对照：激活时由于 BFA 的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生   的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含 BFA 。

(2) 激活对照：激活对照使用细胞表面表达 CD69 来评价激活与否，如果未达到 CD69 期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。

(3) 同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。

4 、Fc 受体阻断：使用试剂阻断 Fc 受体可以有效减少非特异荧光染色，在小鼠可以用纯化的抗小鼠的 CD16/32 （ eBioscience ，目录号 14-0161 ），在大鼠可以用纯化的抗大鼠的 CD32 ，在人可以用过量的同种无关纯化 Ig 或血清。

5 、荧光素的选择：检测相对低表达细胞因子如 IL-4 时，应选用 PE 或 APC 标记；单检测某一细胞因子时最好也选用 PE 或 APC 标记；同时检测多种细胞因子时，弱表达的应选用 PE 或 APC ， FITC 标记最好用于高表达细胞因子如 IFN- γ。

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