流式细胞仪检测专题（三）

三、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）

1 、收获细胞： 肝素钠抗凝的静脉血，按 1 ： 1 与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书）， 混匀后， 37 ℃ ， 5% 二氧化碳培养 4-6 小时。

2、 阻断 Fc 受体：用于消除非特异性的结合染色

(1) 在小鼠，可使用纯化的 FcII/III 受体的抗体（ CD16/32 ），按照 1ug/106 细胞的用量，在染色缓冲液中 4 ℃ 孵育 15 分钟， PBS 清洗后，直接进行下一步染色。

(2) 对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化 Ig 或者血清进行阻断。

3、细胞表面染色

(1) 加适当的细胞表面染色试剂 20 μ L 于 Falcon 管中，加入 100 μ L 激活后的全血 ( 细胞浓度维持在 2 × 106/mL) 混匀，室温暗处孵育 15 分钟；

(2) 加入溶血素，室温暗处孵育 10 分钟。（注意： PMA 激活的全血可能会溶血不完全。）

(3) 离心 500g 5 分钟，弃上清。

4、固定和破膜

(1) 加固定剂，室温暗处孵育 15 分钟，离心 500g 5 分钟，弃上清；

(2) 加破膜剂温暗处孵育 10 分钟。（剂量参照说明书）

(3) 加 2~3mLPBS 洗液，离心 500g 5 分钟，弃上清。

5、细胞内染色

(1) 加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育 30 分钟。

(2) 加 2~3mL 洗液，离心 500g 5 分钟，弃上清，加入 500 μ L PBS 上机或加入 500 μ L 1% PFA 固定后再上机。