原代肝实质细胞三明治夹层培养系统

[示例]：冻存SD大鼠原代肝实质细胞三明治夹层培养

材料与方法

• 原代肝实质细胞 : 冻存SD大鼠原代肝实质细胞（TPCS®，货号CRH-100SDP-PQ, 经贴壁和夹层培养验证批次）。

• 包被培养基 : HCM-R，包括两种组分和两种规格: 

1. 基础培养基 (HCM-BM-40, 40 mL) 和鼠尾胶原蛋白I型（AR0001-02，1 mg）, 

2. 基础培养基 (HCM-BM-120, 120 mL)和鼠尾胶原蛋白I型（AR0001-05，2.5 mg）。 

•  Matrigel基质胶。

• 肝细胞复苏优化培养基 : 即用型完全培养基（TPCS^®，货号HTS-R-120WP/HTS-R-40WP）。

• 肝细胞铺板培养基 : 即用型完全培养基（TPCS^®，货号HPM-R-40/120）。 

• 肝细胞维持培养基 : 即用型完全培养基（TPCS^®，货号HMM-R-120P/HMM-R-40）。

• CDFDA（5-氯甲基荧光素二乙酸酯）。

• 0.4%台盼蓝。

夹层培养操作分为以下6个主要步骤 (见如下示意图）

肝细胞“三明治”夹层培养流程示意图

图 1 : 肝细胞“三明治”夹层培养流程示意图

肝细胞“三明治”架构

1：三明治夹层培养肝细胞中胆小管的形成及荧光CDF的累积

图 2：SD大鼠肝细胞胆小管的荧光CDF累积结果。将SD大鼠肝细胞按照指定密度接种至胶原蛋白预包被的24孔细胞培养板中，在三明治夹层培养条件下，SD大鼠肝细胞于培养第3-4天形成了清晰且密集的胆小管网络（左图）。在用CDFDA孵育10-15分钟后， 观察到由MRP2介导的CDF荧光在胆小管网络中显著分布和累积（右图）。

2：肝细胞三明治夹层培养模型与传统2D单层培养酶活性比较

图 3 : 在37°C条件下，以指定底物浓度分别孵育三明治夹层培养和传统2D单层培养的肝细胞60分钟后，通过LC-MS/MS技术检测生成的代谢产物。I相和II相酶的代谢活性以代谢产物的形成速率计算，结果以每百万细胞每分钟生成的代谢产物皮摩尔数（ pmol/min/10^６ cells）表示，用于表征相应酶的活性。

使用TPCS^®原代肝实质细胞成功构建了SD大鼠肝细胞三明治模型。通过CDFDA荧光染色实验结果，显示该模型形成了完整的胆小管结构，并保持了优良的胆小管功能。与2D单层培养相比，三明治夹层培养模型能够更好地维持肝细胞的代谢功能和整体活性， 使其在药物筛选、毒理学研究和药物代谢研究中具有显著优势。